一、简介

流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种对细胞群体中的单个细胞或类似细胞大小的颗粒进行快速、连续检测的技术。其基本原理是：细胞或其他微粒与相应的荧光素偶联蛋白或抗体结合，基于层流规律的流体动力学聚焦样本形成单细胞流，将单细胞队列快速传输至激光光源与液流正交的位置时，在特定波长的发射光源激发下，形成多角度散射光和细胞携带的各种荧光染料被激发发出特征荧光，这些光谱能够被机器的信号接收器接收，通过光电转换器，将光信号转换为电信号。仪器收集、测量众多单细胞的散射光和荧光信号并进行关联分析。

流式细胞术应用广泛，包括细胞亚群比例及浓度测定、细胞功能分型（活化、耗竭、分化时态、免疫检查点等）、细胞功能相关实验（细胞增殖、凋亡、周期、钙流、杀伤、吞噬功能等）、胞内染色（胞内因子、核内因子、胞内活化激酶等）、分泌细胞因子检测（流式液相多重蛋白定量CBA技术）、微生物学检测（细菌、真菌、病毒等鉴定，微生物活性等）、表观遗传学相关检测等。

流式细胞术检测细胞增殖方法多样，如相对计数、示踪染料标记、Brdu标记、细胞周期、PCNA、CD71、Ki-67等方法，本文主要介绍一种临床样品较为适用的细胞增殖检测方式-Ki-67检测细胞增殖，适用于检测的临床样本类型丰富，包括新鲜全血、冻存外周血单个核细胞（PBMC）、经特殊处理的冻存全血等。

Ki-67检测细胞增殖：

Ki-67抗原是一种与细胞增殖特异相关的核抗原，与核糖体RNA转录相关，在处于细胞周期的活动期（G1、S、G2和M期）的增殖细胞中表达，在静止G0期细胞中不表达，能够用于判断细胞增殖活性。此外，Ki-67在恶性肿瘤中高表达在正常细胞中几乎检测不到，因而逐步成为肿瘤治疗中的明星靶点。

基本检测原理：使用荧光素偶联的抗Ki-67抗体，通过流式分析Ki-67阳性细胞的比例，反应细胞增殖强弱。

由于健康人淋巴细胞亚群中Ki-67表达较低，直接使用健康人外周血或PBMC不益于方法开发和验证，本文中提供一种替代的处理方式，即对健康人样品使用刺激剂进行适当刺激活化，获取Ki-67阳性细胞比例相对较高的样品用于方法建立。部分临床试验中使用促进淋巴细胞增殖的药物，发挥抗肿瘤作用，对于该作用机理的方法建立可尽量选用临床类似的处理方式，如使用临床试验药物进行样品的刺激，替代广谱刺激剂的使用。若验证样品不能完全模拟临床样品处理情况，后续需使用临床样品进行部分验证项的确认，以确保检测方法在临床样品中的适用性。

二、常用的标本类型和处理方法

1. 人外周血：特殊采血管，适当温度储存96小时稳定，保存24小时后，样品经裂红洗涤等处理后，使用细胞冻存液冻存，可于-70℃中长期保存、批量分析。检测实验室进行冻存处理时，对样品运输时效要求相对较高；临床中心具备相关处理能力时，可节省运输成本。

2. 外周血单个核细胞(PBMCs)：抗凝全血，分离PBMC，使用新鲜细胞进行分析或者采用合适的冻存液将细胞在-70℃或者液氮冻存，复苏后进行试验。临床中心需具备分离PBMC能力。

3. 精翰生物自主开发的定制采血管，样品采集后适当温度保存一定时间，可直接将样品储存于-70℃进行长期保存，无需冻存操作、无需程序降温。使用该方法可节省临床中心操作便捷性，同时，可实现批量运输、批量检测，节省项目成本。

三、实验流程

本文阐释通用型方法验证相关实验流程，即使用刺激PBMC进行Ki-67相关检测流程。

1) 采购的新鲜PBMC，使用广谱刺激剂刺激特定时间以获取Ki-67阳性比例合适的样品。

2) 刺激完成，将细胞转至采血管中，适当温度保存。

3) 保存适当时间，可直接用于检测或取出适当体积放于-70℃冻存，长期保存。

4) 细胞转入流式管或者微孔板（对于冻存保存样品需进行复苏预处理），封闭液封闭，表面抗体孵育。

5) 固定破膜，封闭液封闭

6) 胞内/核内抗体孵育。

7) 上机，使用流式细胞仪进行样品检测。

实验流程图解析

四、精翰生物部分测试数据展示

1. 刺激剂刺激不同时间Ki-67阳性细胞比例变化

2. 设置的温度保存稳定性数据（PBMC刺激48小时）

备注：以上仅为某个方法开发数据举例，在不同细胞亚群中稳定性结果有差别，某些项目亚群中Ki-67指标验证至96h稳定性。

Ki-67分群效果图展示（对应表格中Baseline-DT样品）：

3. -70℃保存稳定性数据（PBMC刺激96小时）

备注：更长时间的冻存稳定性待测试。

五、应用

1) 作为癌症治疗的预后指标：越来越多临床研究表明Ki-67可以作为癌症治疗预后评估的潜在指标，作为预后判断金标准，10-14%阳性比例提示有较高的预后风险。

2) 作为癌症治疗的潜在靶点：基于Ki-67在恶性肿瘤中的高表达而在正常细胞中低表达特性，预示着其可能作为癌症治疗潜在靶标。潜在治疗方式包括Ki-67反义核苷酸，anti-Ki-67多肽核苷酸（peptide nucleic acid, PNAS），靶向Ki-67的RNA干扰技术，溶瘤病毒介导的Ki-67-siRNA，抑制Ki-67启动子激活的基因治疗等。

3) 作为免疫细胞激活的潜在靶标：在抗肿瘤药物作用机理中，部分药物可激活机体免疫细胞发挥抗肿瘤活性，对免疫细胞增殖指标Ki-67进行检测，结合临床给药前患者基线表达情况，可用于评估药物对免疫细胞激活情况。

参考文献：

1、 流式细胞术-原理、操作及应用，陈朱波、曹雪涛著，科学出版社出版。

2、 Ki67 targeted strategies for cancer therapy, C. Yang, J. Zhang, M. Ding, et al. :DOI 10.1007/s12094-017-1774-3.