前言

多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一种危及生命且高度异质性的疾病，发病率在血液系统恶性肿瘤中排名第二位，目前仍无法治愈。临床上常通过多参数流式细胞术（multiparameter flow cytometry，MFC）可识别浆细胞异常抗原表达并精确判断其克隆性，常用于多发性骨髓瘤（MM）微小残留病（MRD）的检测，以评价治疗的有效性并预测预后。近年来，尽管在化疗、蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂利沙度胺衍生物、CD38靶向抗体方面取得了很大进展，但几乎所有患者终将复发，其根源是存在MRD，因此检测MRD对于判断疗效、指导治疗及预测预后有着重要意义。

MRD检测一般流程

目前国内MM-MRD常用8-10色抗体组合行胞膜和胞质抗原检测，欧洲流式学会建议应用2管8色抗体组合的二代流式细胞术（Next generation flow cytometry，NGF），但在我国还不能普遍应用。我们在日常工作中发现，初诊MM患者高表达CD38和CD138，异常表达CD45、CD19、CD20、CD56、CD81和CD117等胞膜抗原，限制性表达胞质轻链cKappa（cκ）或cLambda（cλ）。

下面介绍通过流式细胞术检测MM MRD一般流程

（1）样本采集

        骨髓（BM，优选）或外周血（PB）

        EDTA（优选）或肝素钠抗凝，3-5ml

        运输存储条件：4-8℃，48h之内检测。

（2）样本制备

        先裂红再染色，或先染色再裂解，都是可以的。如果样本细胞密度低，为了收集到足够的细胞数量，建议用前一种方法，但裂解液需注意，要用无固定剂的氯化铵裂解液。对于胞质抗体需要事先用1×PBS至少洗涤三次，破膜处理后再加入胞质抗体。密度梯度离心不建议，这样容易导致浆细胞丢失，ficoll会加速浆细胞表面CD38和CD138的丢失。

（3）设门分析

        建立CD38/Time参数图，选择液流稳定区域，接着利用FSC-A/FSC-H去除非特异和黏连体，最后通过CD38/CD138和/或CD38/CD45进行设门，圈出浆细胞，通过其他抗原即可进一步圈出正常浆细胞和异常浆细胞群体，最终通过cKappa/cLambda比值确定浆细胞的克隆性。

（4）MRD结果判断

        绝大多数正常浆细胞表型为CD38++CD138+CD45+CD19+（>75%）CD27+CD56-CD81+CD117-，非限制性表达轻链cKappa或cLambda（cyk或cyλ）；异常浆细胞免疫表型会出现CD45、CD19、CD27、CD38、CD81的异常低表达或不表达，以及CD56、CD117的异常表达，且限制性表达轻链cKappa或cLambda（cyk或cyλ）。

正常浆细胞和异常浆细胞相关抗原表达

案例展示

病例一，流式二维散点图如下

这是一个通过CD38单抗治疗后的病例，通过流式二维散点图分析发现该病例的MRD结果阳性，异常细胞（图示红色）免疫表型为CD45-CD38-CD138+CD19-CD56-CD27part，轻链cLambda呈限制性表达。通过CD38单抗的靶点治疗，MRD仍然阳性，但此时的CD38靶点已经消失，后续监测不能用CD38作为设门抗体。

病例二，流式二维散点图如下

通过流式二维散点图分析发现该病例MRD结果阳性，异常细胞（图示红色）免疫表型为CD45-CD38-CD138+CD56+CD27-BCMApart，轻链cKappa呈限制性表达，同样将CD38作为靶点治疗，治疗一段时间后，该靶点消失，MRD仍然阳性，后续监测不能用CD38作为设门抗体。

病例三，MM初诊病例，流式二维散点图如下

根据流式二维散点图分析，异常细胞（图示红色）初诊免疫表型为CD45-CD38++CD19-CD56++CD27-BCMA+（dim），轻链cKappa呈限制性表达，后续治疗后可以通过上述表型进行MRD监测。

病例四，表型异常的多克隆浆细胞，流式二维散点图如下

红色细胞群免疫表型CD45-CD19-CD38++CD138+CD27+CD56+，轻链cKappa、cLambda呈多克隆表达。

治疗进展

CAR-T技术在目前备受关注，CAR-T治疗已经在血液恶性肿瘤治疗中取得了长期的临床疗效和成功的商业转化。当前最热门的靶点仍然是CD19，但在浆细胞肿瘤上CD19的表达比较少，因此将BCMA作为联合治疗的靶点发挥出了它的潜力。B细胞成熟抗原BCMA（又叫CD269，也叫TNFRSF17，TNF配体超家族成员）是肿瘤坏死因子受体超家庭的成员，主要在浆细胞和成熟B细胞中表达，在多发性骨髓瘤（MM）的增殖、存活和肿瘤进展中起着至关重要的作用。目前处在临床前和临床阶段的靶向BCMA的MM疗法主要包括抗体药物偶联物、双特异性抗体和嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。

BCMA-targeted immunotherapies

结语

随着靶向治疗的日趋发展，在MM的免疫分型和MRD检测中，对于作为靶点的标记，在方案设计中应将该靶点抗体加入对于临床评估、诊断、治疗十分有必要，同时需要注意例如CD38作为靶点，会导致某些复发的病人CD38转阴，所以在设门的时候需要格外关注，必要的时候采用一些其他抗原进行辅助设门可以更准确的进行监测。

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