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酶联免疫斑点技术（Enzyme Linked Immunospot Assay，简称ELISPOT）是细胞免疫学研究中最敏感的检测方法，可以在单细胞水平对抗体分泌细胞(如B细胞)及细胞因子分泌细胞（如T细胞）进行检测，可达20-25斑点/100万细胞，由于该方法是进行抗原刺激后免疫细胞的功能性检测，因此也具有极佳的生理相关性。
ELISPOT常用于疫苗领域药效学评估, 是mRNA感染性疫苗和mRNA/DC肿瘤疫苗药效学评估中关键的技术方法，也是AAV based药物细胞免疫原性评估重要的技术手段。
ELISPOT基本原理是通过免疫细胞和对应刺激物进行共培养，类似于ELISA双抗夹心法对有刺激反应的免疫细胞进行检测。由于免疫细胞激活机理的复杂性性，根据免疫细胞的来源选择，刺激物的类型，刺激方式的不同会衍生出不同的应用方向，以及不同灵敏度的ELISPOT检测方法，简要的技术流程如图1所示：
图1. ELSIPOT检测流程图
在基因治疗药物的临床生物分析实践中，细胞免疫原性检测有诸多的难点：
1. ELISPOT通常需要刺激物和对应阳性PBMC才能进行方法学验证，在实际的方法学验证过程中由于刺激物对应的阳性PBMC不易获取，的因此有些检测机构的做法是，方法并不进行验证。即使进行验证也通常采用CEF作为刺激物，筛选健康人PBMC作为阳性PBMC进行方法学的精密度，稳定性以及稳固性验证，从而证明整体平台体系的可靠性。熙宁生物秉持严谨可靠的方法开发验证质量要求，除采用CEF刺激阳性PBMC作为主体验证外，基于对于基因治疗药物原理的了解，在正式样品分析前会进行专属于该基因治疗药物的特异性较差验证，如对于AAV治疗药物，会基于AAV病毒载体存在预存的阳性PBMC，对于AAV药物的细胞免疫原性检测，筛选出健康人群体中的阳性PBMC，进行AAV衣壳蛋白多肽库的交叉验证，确保在进行样品分析前检测方法的可靠性。
2. ELISPOT的检测结果会受到样品PBMC本身的质量的影响较大，如果PBMC分离或者保藏不当，很可能会失去功能学活性，导致假阴性的结果。ELISPOT检测结果同时受到样品PBMC本身免疫状态影响，如在采集时处于免疫活跃状态，会出现较多的背景斑点，检测结果得到的斑点数会是假阴性。因此，为了得到更加真实可靠的实验结果，进行样品分析时，如图2所示，对于每一个样品均会设置CD3刺激组来监控PBMC的功能活性，Medium分组来监控PBMC的免疫背景，在此基础上进行特定抗原的检测分析。
图2. ELISPOT样品分析体系
3. ELISPOT作为最为灵敏的检测技术，结果受到的影响因素较多，样品进行分析时往往会出现异常的数据，很多供应商只汇报检测斑点结果，并不能有效的进行数据解读。熙宁生物对于ELISPOT检测技术和细胞免疫具有深刻的理解，基于CD3组的方法学验证数据得到了PBMC最小响应阈值MIR，基于Medium组的方法学验证数据得到最小效应限LOD，结合实践情况，会对每一个检测数据进行充分的结果，，确保数据的科学性和合理性。
在基因治疗药物的临床生物分析实践，细胞免疫原性检测有以下关键点：
1. 如图3展示的T细胞激活原理，ELISPOT方法学的灵敏度跟刺激物选择有关，通常情况方法的灵敏度的高低排序为，含有多肽复合物的抗原递呈细胞>多肽>蛋白/病毒颗粒。对于肿瘤疫苗和DC疫苗，由于机体免疫细胞对其反应比较温和，建议使用最为灵敏的刺激物。熙宁生物有丰富的稳转细胞株和免疫细胞培养经验，可进行有多肽复合物的抗原递呈细胞的培养和制备，设计更加复杂也更加灵敏的ELISPOT检测方法。
图3. T细胞激活原理
2. 在临床检测过程中，从全血样品采集到分离PBMC的中间时间不应超过8小时，不然分离出来的的PBMC的功能活性会受到极大影响，造成大部分样品假阴性的结果。对于这个在临床检测分析的痛点，熙宁生物自主开发了相应的方法，可将全血分离PBMC的稳定时间延长至48小时，在保证检测结果真实可靠的前提下，满足临床运营商，从从临床中心进行样本采集运输到分析实验室的可操作性，考察结果如4所示：
图4. 熙宁全血稳定性测定结果
细胞免疫原性评估对象是PBMC，但PBMC由于全血采集后的稳定性较差，且免疫背景较为复杂，使得ELISPOT的检测结果的解析变得极为复杂，甚至很多时候检测结果本身也有失真的风险。需要基于对方法和作用机理的充分理解，来保障检测的顺利进行。熙宁生物通过合理的样品分组设计，方法学参数验证确定，会对每一个临床样品的检测数据进行充分解读。同时基于临床试验样品全血采集后稳定性较短的难点，研发了一款全血稳定剂，可将全血采集后的稳定时间延长到48小时，在确保样品稳定结果真实的情况下尽可能了便利临床运营。
基因治疗作为热门的新兴疗法，近些年发展迅速。同时，基因治疗药物研发需求多样化、技术复杂度高的特点，也对检测分析带来巨大挑战。熙宁生物搭建了基于基因治疗药物检测需求的基因检测平台、细胞/病毒检测平台、流式检测平台和免疫检测平台等，能够满足研发项目在不同阶段的在生物分析需求。团队专注于GCT领域，积累了丰富的实战经验和专业的技术服务能力，通过qPCR/ddPCR技术、细胞法中和抗体检测技术、ELISPOT细胞免疫原性检测技术、流式检测技术、ELISA/MSD检测技术等多平台技术互联，打通技术隔阂，真正实现“一个临床/项目，一个生物分析实验室，一个技术项目团队”的服务方式，为基因治疗产品生物分析提供完整解决方案。
