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小干扰RNA（Small interfering RNA； siRNA ）属于小核酸药物中重要的一种药物类型，也被称为短干扰RNA（short interfering RNA）或沉默RNA（silencing RNA），是一个长20到25个核苷酸的双股RNA，在生物学上有许多不同的用途。其结构如图1a所示，双链RNA由正义链和反义链组成，在3‘端有两个碱基的游离，未经修饰的siRNA在体内很快被降解，目前主要采用纳米递送系统（图1b）或者设计成GalNAc（乙酰半乳糖胺）-siRNA复合物（图1c）。该药物作用机理如图2所示，siRNA片段与RISC（RNA诱导沉默复合体）结合，RISC由Argonaute-2 （Ago-2）、Dicer和TAR-RNA-结合蛋白（TRBP）组成。然后RNA的两条链分开，其中一条链从复合物上分离。5'端双链稳定性最低的那条链被选择出来，稳定的并入沉默复合物中，可激活RNA干扰，通过与目标mRNA互补结合序列特异性地实现mRNA降解。
目前，siRNA药物在中国大陆已有获批上市的案例，展现出巨大的市场潜力，并有多起对外授权案例。国内在这一领域的代表企业包括苏州瑞博、恒瑞医药、圣诺制药、舒泰神、舶望制药等，正在推动RNAi疗法从实验室走向临床，为疾病治疗带来新的突破。
图1a
图1b
图1c
图2
基于LC-MS检测siRNA有诸多难点，比如化合物极性大、色谱保留弱。此外siRNA药物为双链结构，需要进行双链解链，检测单链浓度。这需要将正义链和反义链在色谱保留上尽量分离，降低双链的相互干扰的影响；由于药物容易被限制性核酸内切酶降解，因此需要重点关注稳定性问题；在质谱检测方面，由于其检测局限性，对于分子量较大的siRNA药物，一般以多电荷形式呈现，此外强酸性化合物需要在负离子模式下进行，该药物还易与金属离子螯合等诸多因素导致了在LC-MS检测siRNA灵敏度方面具有巨大的挑战；常规的样品前处理（蛋白质沉淀、液液萃取、固相萃取）方法不能适用于siRNA药物的提取，因此需要在提高提取回收率、前处理效率和结果重现性方面做出更多的努力。下面总结了熙宁|精翰基于LC-MS检测siRNA的相关实验内容。
前处理
本实验采用液液萃取方法，如图3，该方法前处理简单，耗时短，重现性好，成本低廉，非常适合高通量的样品前处理。实验操作需在冰浴黄光下操作保证样品中待测物稳定性。
图3
线性、精密度和准确度
本实验线性范围为正义链5~2500 ng/mL，反义链5~2500 ng/mL，代表性标准曲线见图4a（正义链）和图4b（反义链），相关系数均r＞0.999。表明线性关系良好。
通过考察3个分析批，5个浓度质控样品，用以评估该方法的精密度和准确度。结果显示批内精密度和准确度（含LLOQ QC的所有浓度质控）准确度偏差范围为-7.6~10.1%、-8.5~9.3%，%CV最大值分别为7.3%、6.4%；批间精密度和准确度（含LLOQ QC的所有浓度质控）准确度偏差范围为-5.0~6.7%、-6.3~8.3%，%CV最大值为5.0 %、5.4%。
图4a
图4b
选择性
选择性考察不同来源的空白基质以及高脂，溶血基质，评估空白基质对待测物和内标的干扰。同时考察了内标对待测物的干扰。图5a为空白基质图谱，图5b为定量下限和内标图谱；
图5a
图5b
不同提取方法的比较
目前大部分样品检测提取方法都是采用液液萃取，但是对于特殊样品，例如组织样品，还会使用固相萃取的方法。但是固相萃取前处理复杂，成本高，处理通量低等缺点，大大制约了检测时效性和经济性。熙宁生物最早在2021年已经使用液液萃取方法全面替代固相萃取法，如图6所示，比较了相同浓度下不同提取方法的色谱图，性能等同，适用于绝大部分组织，例如，肾脏，肌肉，肝脏，脂肪，脑组织等。
图6
此外本实验同时考察了不同个体间基质效应，高脂溶血基质效应，提取回收率、全血稳定性，以及基质中稳定性，包含短期稳定性、长期稳定性、处理后样品稳定性等，所有验证项目均满足接受标准，表明该方法能用于后续的临床样品分析。
熙宁|精翰质谱平台能够提供符合NMPA/FDA/OECD/EMA的各项生物样品分析服务，支持小分子药物、多肽、寡核苷酸、PROTAC、ADC以及大分子抗体等药物的方法开发、验证和样品检测。平台配备了多套高端液质联用系统和Watson LIMS在内的生物分析系统和软件系统，各种先进辅助设备，不仅可以满足各型实验的检测需求，还大大提高实验效率和质量。 我们能够更快、更好的为客户提供专业的技术服务，更高效地帮助客户完成药品研发。
