基于细胞平台的中和抗体检测方法开发——Claudin18.2抗体 NAb 方法开发为例
来源:宁波熙宁检测技术有限公司    |    发布时间:2020-12-30 10:37:00    |    点击:

基于风险评估的免疫原性测试


所有的治疗用蛋白都可能会在病人体内引起一定水平的非必要的免疫反应,在药物研发过程中需要监控药物引起的免疫原性。免疫原性的数据对于解读药代动力学,药效动力学和安全性都十分重要。免疫原性测试的模式和频率均要基于风险评估,风险评估包含多个要素,包括该蛋白潜在的免疫原性(人源/非人源抗体),生理学作用,用药途径(吸入/皮下/注射),治疗持续的时间(一次/多次),病人的状态,适应症等,如下表所示从多个维度评估治疗性蛋白的高风险和低风险。





   比较严重的案例是由于治疗性药物引起的抗体会中和药物,同时也会中和药物相同的内源性蛋白,从而导致自身免疫综合征如血小板减少,纯红细胞再生障碍性贫血等,内源性的重组表达蛋白类药物便是此类高风险药物的代表。



中和抗体测定


机体免疫反应产生的抗药抗体(ADA)能够结合治疗性蛋白,也可能能够在体内阻断治疗性蛋白的生理学活性作用,这类有阻断作用的抗药抗体称之为中和抗体(NAb)。抗药抗体(ADA)测定和中和抗体(NAb)测定是蛋白药物免疫原性评估的主要内容。中和抗体(NAb)测定对于解释治疗性蛋白在体内的有效性和安全性均十分重要。中和抗体(NAb)测定方法的平台主要可分为基于细胞的,和基于非细胞的。由于细胞学方法和药物体内环境的生理学更佳的相关性,EMAFDA免疫原性测定的指导原则文件均表现出其对于细胞学中和抗体检测的偏好性,如下图根据USP免疫原性方法指导原则USP <1106.1> Immunogenicity AssaysDesign and Validation of assays to Detect Anti-Drug Neutralizing Antibodies,建议使用细胞学方法检测NAb(标记红色下划线)。





细胞学方法进行中和抗体检测基本上可分为两大类:基于细胞结合的检测模式和基于细胞内一系列的生理功能的检测模式。基于细胞内一系列的生理功能的检测模式有多种多样,包括细胞增殖,凋亡,毒性的检测,报告基因检测,细胞分泌因子/表达蛋白的检测,ADCC/CDC等效应功能的检测等,根据USP 1106.1总结的细胞学方法进行中和抗体检测方法如下:





中和抗体检测方法:基于细胞或者基于非细胞?


  尽管EMAFDA指导原则偏爱细胞学方法进行NAb检测,但并不是法规性质的强制规定,选择基于细胞或者基于非细胞的NAb检测方法要基于风险的评估(高风险类药物应进行早期和持续的检测,需要采用更加灵敏和更具生理学的意义的分析方法进行检测),也需要基于药物的作用机理(MOA),细胞或者基于非细胞NAb检测方法的开发难度,检测的稳定程度,灵敏程度以及与体内环境的生理相关性等多方面的因素。来自Amgen的科学家团队报道过三个药物临床研发阶段采用基于细胞和非细胞方法进行NAb检测的对比,方法参数对比如下图:





   由于细胞学中和抗体检测方法是体外生理学相关的检测系统,Amgen的科学家团队核心思维模式是通过非细胞学中和抗体检测方法对标细胞学中和抗体检测方法来判断非细胞学中和抗体检测方法是否准确,并通过药物的药效药代数据来侧面印证细胞学中和抗体检测方法是否准确。实验结果表明三个临床药物的中和抗体检测中高风险的重组EPO蛋白药物在细胞学方法和非细胞学方法有相当一致的表现。两个抗体药物中,AMG-X在细胞学方法和非细胞学方法有相当一致的表现,而AMG 317在非细胞学方法中有50%以上的阳性样品(相对于细胞学方法)并未检出阳性。根据对比结果Amgen的科学家团队建议对于高风险的药物,非细胞学的中和抗体检测方法投入使用前,应该和细胞学方法中和抗体检测进行初步对比。



精翰生物基于细胞平台的中和抗体检测方法开发


    细胞学方法相对于非细胞学方法用于NAb检测,有更佳的生理相关性,但是细胞学的开发周期长,方法稳定性相对性较差,受基质和血液药物浓度的影响较大使得细胞学中和抗体的检测方法是一件很有挑战的事情。每一个临床蛋白药物都有其独特的结构,产生的抗药抗体和中和抗体水平差别很大,在NAb方法学验证中需要使用的中和抗体阳性对照也不会一样,不会有经过完全验证的细胞学NAb检测方法可以立刻用于临床样本的检测,每一个创新型临床蛋白药物均需要有一个私人定制的细胞学NAb检测方法。在样本检测之前关键细胞和试剂的准备,方法开发和优化,方法的验证均需要大量的时间,对人员的经验有较高的要求。

    精翰生物的细胞实验平台专注于以稳转细胞系为核心材料进行临床和临床前生物分析检测相关工作,从稳转细胞株的构建,中和抗体分析方法开发和优化,到分析方法的验证和样本分析,提供一体化全流程的细胞学生物分析方法服务。以Claudin18.2抗体NAb方法开发为例,部分研发阶段方法初步开发和优化的数据(验证工作需要有特定药物的阳性中和抗体,未公布)如下:

Cell Based binding NAb assay开发-Claudin 18.2靶点

Claudin18.2抗体在人血清基质中与细胞的剂量曲线





使用精翰生物自主研发高丰度表达的Claudin18.2 CHOK1稳转细胞株,开发了基于细胞结合的药物-信号剂量曲线。通过调整实验条件,优化抗体和细胞结合的剂量曲线,构建了初步NAb检测方法的骨架。优化后相对于优化前,复孔CV有极大改善,同时改善了药物浓度较大时引起的Hook效应。


Claudin18.2抗体结合信号的整板一致性




使用不同浓度的Claudin18.2抗体,采用高中低信号测定在96孔板中的信号整板一致性,优化前方法从左到右有明显的信号偏移,优化后有较为一致的信号值,排除了细胞板空间效应对细胞学实验检测信号的影响。


NAb Cut point 定值





优化后,方法的MRD20,用pooled serum作为NC,使用32individual serum进行测试评估,测得初步的Cut point0.88

     类似Claudin18.2抗体基于细胞结合的中和抗体检测方法适用于靶点是多次跨膜蛋白的药物,如CD20抗体,Claudin18.2抗体,GPCR抗体等。



细胞结合的中和抗体检测方法在CART中应用


细胞治疗产品会引起炎症反应,且会在体内持续存在,其属于高风险的治疗药物。嵌合抗原受体T细胞免疫治疗产品,其嵌合抗原受体的实质是特异性识别靶点抗原的抗体片段如scFv, scFv作为外源性的蛋白可能会引起免疫原性,其中和抗体的检测方法该如何做呢?在缺乏相关方面指导原则和案例的前提下,笔者认为基于细胞结合的中和抗体检测方法更加适用于CART的中和抗体检测,构建能够表达CAR的稳转细胞株,使用靶点蛋白作为结合的配体,采用类似上文Claudin18.2抗体的细胞结合中和检测的模式进行方法开发和检测将会是较好的解决方案。

相对于非细胞学方法,如将scFv重组表达出来进行非细胞的中和抗体检测,细胞学方法更具有生理学相关性,原因在于scFv重组蛋白的理化性质相对不太稳定,容易形成聚体,相对其在细胞表面可能会减弱甚至丧失其对于靶点蛋白的亲和力和特异性。究其原因是scFv以抗体的形式存在,在细胞膜上表达还是以重组蛋白的形式存在,其空间结构有发生变化的风险,Andrey Krokhotin2019)记载一个靶向HER2 MHC多肽复合物的高亲和力特异性抗体SF2 antibody,将其改造成scFv安装在T细胞表面作为CAR后,该CART除了能够被HER2 MHC多肽复合物的T2细胞激活外,还能够被非靶点相关的MHC多肽复合物T2细胞激活,丧失了其特异性。如果scFv的空间结构会受到不同存在形式的影响,那么中和抗体的检测以scFv重组蛋白作为检测目标,相比以表达到细胞表面的scFv作为检测目标,进行检测有失真的风险。

 精翰生物提供抗体类药物靶点稳转细胞系,如Claudin18.2CD20GLP1R;受体功能报告基因细胞系,如GLP1R-CREB-luciferase-HEK293TPD-1-NFAT- luciferase-JurkatCAR-稳转细胞株的构建等。以及基于稳转细胞系的中和抗体分析方法开发,优化,到分析方法的验证和样本分析的服务,已有初步平台建设方法开发的经验,欢迎合作咨询!

 

参考资料:

1.  1106.1- IMMUNOGENICITY ASSAYS-DESIGN AND VALIDATION OF ASSAYS TO DETECT ANTI-DRUG NEUTRALIZING ANTIBODY

2.  Koren E , Smith H W , Shores E , et al. Recommendations on risk-based strategies for detection and characterization of antibodies against biotechnology products[J]. Journal of Immunological Methods, 2008, 333(1-2):1-9.

3.  Hu J , Wala I , Han H , et al. Comparison of cell-based and non-cell-based assay platforms for the detection of clinically relevant anti-drug neutralizing antibodies for immunogenicity assessment of therapeutic proteins[J]. Journal of Immunological Methods, 2015, 419:1-8.

4.  Krokhotin A, Du H, Hirabayashi K, Popov K, Kurokawa T, Wan X, Ferrone S, Dotti G, Dokholyan NV. Computationally Guided Design of Single-Chain Variable Fragment Improves Specificity of Chimeric Antigen Receptors. Mol Ther Oncolytics. 2019 Aug 31;15:30-37. doi: 10.1016/j.omto.2019.08.008. PMID: 31650023; PMCID: PMC6804740.