均相时间分辨荧光共振能量转移(HTRF)技术在生物分析实验的应用
来源:宁波熙宁检测技术有限公司    |    发布时间:2020-12-30 10:28:00    |    点击:

生物药新药开发的整个周期都离不开生物分析的支持,尤其是当新药开发进入临床阶段,更是要求生物分析方法得到全面的验证。目前最广泛应用的生物分析技术包括传统的色谱方法如高效液相色谱(HPLC),基于质谱的方法如液质联用(LC-MS)等和基于配体结合的方法〔电化学发光法(ECL)和酶联免疫吸附测定(酶标法,ELISA)〕,也有很少的一部分使用放射性免疫测定法(RIA)。以上生物分析技术在不同的领域都有各自的优势和应用。例如HPLCLC-MS 广泛用于小分子药物药代动力学(PK)的生物分析,酶联免疫吸附测定法成本低,适用性广,开放性好,几乎覆盖所有类型的生物分析。 电化学发光法凭借着高灵敏度和重复性好,广泛应用于免疫原性评价。相对于以上几种LBA方法,HTRFHomogeneous Time-Resolved Fluorescence,均相时间分辨荧光共振能量转移)技术无放射性,操作简单,实验环节少,实验周期短,且反应体系稳定,抗干扰能力强,非特异性背景低,灵敏度好,也越来越多的应用到LBA方法的生物分析当中。现阶段生物分析领域,HTRF技术更多的是应用于生物标志物(Biomarker)和中和抗体(NAb)的检测,很少有研究人员将其用于药代动力学(PK)和抗药抗体(ADA)的检测。



HTRF 技术原理

HTRF技术是同时兼具TRFTime-Resolved Fluorescence,时间分辨荧光) 技术和FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer,荧光能量共振转移) 技术的在均相(溶液)反应体系中的分析技术。

TRF 技术利用稀土元素中镧系元素(第57号元素镧到71号元素镥15种元素的统称)的独特性质,其荧光比普通荧光持续时间更长,普通荧光的半衰期为纳秒级,镧系元素的半衰期是毫秒级,有6 个数量级的差别。所以,在检测时,每个激发光脉冲过后,通过延缓检测时间,让短寿命的荧光衰变掉后,再检测稀土穴状化合物的荧光强度,几乎可以完全消除背景荧光的干扰,提高灵敏度,反映样品的实际情况(图1-左)。

FRET 技术(图1-右)利用了2 种荧光基团的能量转移,这2 种荧光基团分别称为能量供体和能量受体。能量供体被外来光源激发(例如氙灯或激光),如果它与受体比较接近,可以将能量共振转移到受体上,使受体受到激发,发出特定波长的发射光。当供体和受体分别与相互作用的2 个生物分子结合,生物分子的结合可以将能量供体和受体拉到足够近的距离,产生能量转移。由于受体的发射光来自于能量转移,所以实验中不需要将未结合与已结合的分子分开,即不需要洗涤步骤,大大减少了实验操作步骤。

HTRF技术同时应用了以上两种技术原理。能量供体选择镧系元素铕(Eu)和铽(Tb)的穴状化合物,在这个穴状化合物里,Eu Tb 被永久地嵌合在1 个笼子里,结构非常稳定,对温度、pH、金属离子、螯合物等耐受性极强。HTRF 的能量受体也有2 种,交联别藻蓝蛋白(cross-linked APC,商品名XL665)和小分子荧光探针d2,它们的光学性质相同,相对分子质量不同。前者相对分子质量为1.05×105,实际上就是改良过的别藻蓝蛋白(APC)。后者相对分子质量较小,约为1×103,可减少空间位阻对实验的可能影响, 因此应用更广泛。在检测时,通过延缓检测时间,让短寿命的荧光衰变掉后,再检测荧光强度,消除背景荧光的干扰。同时HTRF 技术在均相(溶液)中一步反应,无需包被、封闭、洗涤等繁琐的操作步骤。因此该技术具有背景低,特异性好、操作简单,体系稳定等优点。



图一:TRF技术与FRET技术原理



HTRF技术在生物标志物(Biomarker)的生物分析的应用


实验原理

如图2所示,铽标记的Biomarker抗体(供体)和d2标记的Biomarker抗体(受体)通过Biomarker形成抗原抗体复合物。当染料离得很近时,用外来光源(例如氙灯或激光)激发供体释放一种荧光共振能量转移(FRET)到受体,而受体又在特定的位置发出荧光波长(665 nm)。信号强度与形成的抗原抗体复合物的数量成正比。



2 HTRF 法测生物标志物原理



实验过程




优点:

1,免洗均相检测,操作简单, 无需分离和洗涤步骤,二步操作Mix&Read

2,省时省力,操作一般仅需2h

3,实验体系稳定, 7天内可随时检测,信号基本不变。

4,可检测样品样品量低至 5 µL,适合珍贵样品。

5,支持384孔板,节约试剂,通量大。



HTRF技术在Cell-based NAb 生物分析的应用

HTRF 技术在免疫原性评价,尤其是Cell-based NAb评价有着得天独厚的优势,因为应用该技术可以实现活体(即活细胞)、原位条件下从药物在其发挥药效的完整生理作用机制(MOA)角度评估中和抗体对药物活性的影响。因此近年来,HTRF技术越来越多用于生物药中和抗体的评估中。

例如辉瑞最近正在研发一种新型生物药,PF-06730512,用于治疗局灶性节段性肾小球硬化(FSGS)。在其临床二期评估了成人原发性FSGS的疗效、安全性、耐受性和药代动力学,其中针对中和抗体的评估就选用的HTRF技术。基于PF-06730512发挥药效的生理机制,选用表达SNAP标记的人环行交叉口受体2ROBO2)的HEK293细胞株(细胞在使用前用SNAP-Lumi4-Tb标记)作为平台,通过检测狭缝引导配体2SLIT2-d2与其受体结合后产生HTRF信号,评估中和抗体的强弱。

如图3所示, NAb不存在时,SLIT2-d2SNAP-ROBO2的结合不受阻碍并产生强烈的HTRF信号。当着NAb存在时,SLIT2-d2结合被抑制,导致HTRF信号减弱。




3 HTRF法检测抗PF-06730512中和抗体原理



实验过程(简述)

1HEK293细胞株培养;

2HEK293细胞的SNAP-Lumi4-Tb标记(过夜孵育);

3,向96孔板(浅孔板)中加入10µL HEK293细胞和 10µL血清样品,常温孵育1小时;

4,向96孔板(浅孔板)中加入10µL SLIT2-d2,常温孵育1小时,读板。



优点:

1,免洗均相检测,操作简单, 无需分离和洗涤步骤,二步操作(除了细胞培养和标记)Mix&Read

2,省时省力,操作一般仅需2h

3,实验体系稳定, 7天内可随时检测,信号基本不变。

4,可检测样品样品量低至 5 µL,适合珍贵样品。

5,支持384孔板,节约试剂,通量大。

6,符合生理机制,更真实。



HTRF技术在PK 生物分析的应用

HTRF 技术目前在PK生物分析应用较少,相信随着HTRF技术(尤其是标记技术)的成熟,和商业试剂和仪器的普及推广,会有更多的研究者将其应用于PK。例如丽珠单抗生物技术有限公司使用HTRF法测定重组抗TNFα单克隆抗体在细胞发酵液中的浓度,并对分析方法做了详细的验证。 经验证方法有很好的特异性、准确性和精密度,稀释线性良好。通过HTRT法与ELISA法测定结果进行比较,两种方法测得结果基本一致。




4 单克隆抗体PK方法检测原理



实验过程





优点:参见上文Biomarker



HTRF技术在ADA(非Cell-based NAb)生物分析的应用

国内外未发现HTRFADA(非Cell-based NAb)当中的应用,不过笔者认为原理上是行得通的。在传统MSD桥连ADA 方法中,样品中的ADAbio-DrugSulfo-Tag-Drug 形成复合物。而在HTRF法中,样品可以与Tb(或Eu)标记的Drugd2标记的Drug形成复合物。与传统的MSD桥连法ADA 方法相比。少了包被有链霉亲和素的平板抓取和洗涤的过程,去除标记药物活性引起的差异,HTRF 法理论上应有更好的灵敏度。技术的难点在于Drug的标记技术,这一点PerkinElmer-Cisbio已经有了相应的标记试剂盒(d2 labeling kitEu Cryptate labeling kitTerbium Cryptate labeling kit)


结语


现阶段HTRF法在生物分析领域应用较少,但基于该技术有其独特的优势(如支持Cell-based 方法和大幅度缩短实验周期),有着不错的应用前景和开发空间。尤其是随着试剂(细胞)标记问题的解决和Envision 等支持HTRF仪器平台的普及,HTRF法将更多的应用于生物分析领域。



参考文献

1.       均相时间分辨荧光法测定抗PD-1/PD-L1 单抗药物活性。药物分析杂志Chin J Pharm Anal 2019,39(1)

2.       均相时间分辨荧光( HTRF)法测定重组单抗含量。中国生物工程杂志 China Biotechnology,2013,3312:64-68

3.       Development of a Cell-Based Assay for the Detection of Neutralizing Antibodies to PF-06730512 Using Homogenous Time-Resolved Fluorescence. The AAPS Journal (2020) 22:56 DOI: 10.1208/s12248-020-0431-x

4.       Cisbio Product Insert IgG(h) Kit/6FHIGPEG

5.       Cisbio Product Insert Glucagon (serum) Kit/62SGLPEB-62SGLPEF