针对药物的不同特性,解析抗药抗体(Anti-Drug Antibodies)测定的Assay format
来源:宁波熙宁检测技术有限公司    |    发布时间:2020-12-17 16:55:00    |    点击:


生物药物引起的免疫应答在某些情况下可能导致潜在的严重副作用和/或药物失效。因此,此类药物的免疫原性是药企,监管机构都非常关注的问题。为了评估这些分子的免疫原性,适当的检测,定量和表征抗体是必要的。设计不适当的抗药抗体试验可能影响产品的开发和上市。

为了评估生物药物分子的免疫原性,并能够将实验室结果与临床事件相关联,重要的是开发可靠的实验室测试方法,在非临床和临床研究中提供有效的抗体反应评估。因此在ADA的分析中,必须具有足够的灵敏度和高特异性,才能准确地检测和表征ADA对这些药物的反应。许多文献和行业白皮书已经发表了详细的开发验证ADA筛选、确证和滴度的测定方法来支持用于免疫原性评估的分级方法。2019版FDA免疫原性指导原则也对免疫原性分析方法做了相关内容的详细阐述和规范。

本文根据作者多年的大分子药物生物分析工作经验,更多侧重从药物不同特性的角度提出了用于临床前或临床研究的抗药抗体测定方法设计的建议。

从分析物(analyte)谈ADA检测的特殊之处

1. ADA的测定同药代动力学(PK)的分析不同。PK是定量检测一个特定的分子,分析物是明确而且高度特异的。ADA则不同,分析物为“抗药抗体”,所谓抗药抗体,是生物体对针对这个外来药物的不同抗原决定簇产生的抗体的总和,是一类“混合物”。

2. ADA的测定缺乏理想的标准品(对照),尤其是对于临床研究。其方法开发,验证及样品分析中的阳性对照抗体大多来源于动物,比如最常见的兔多抗。对于临床或非临床(猴,小鼠等)的样品,这样的阳性对照抗体不能完全等同于真实种属的阳性样本。所以,在进行ADA的方法开发之前,需要对ADA阳性对照抗体进行一定的考察,比如纯化方法,与药物的亲和力等,以此初步判断此阳性抗体的特性,进而选择亲和力和特异性较好的阳性对照。


ADA assay format

针ADA对这种“混合物”,最好的捕获试剂和检测试剂即是引起这种抗体产生的药物。使用药物作为捕获抗体和检测抗体不仅能保持方法较好的亲和力和特异性,更重要的是,能够全面的检测这个多抗混合物。

一. ADA方法中最经典的assay format 是将药物作为捕获抗体和检测抗体的桥连法,即将药物分别进行生物素标记和钌标记,生物素标记的药物和钌标记的药物混合在一起同ADA样品孵育一定的时间(ADA的两条抗体臂同两种标记的药物分别连接,形成桥连的形式),在MSD平台上检测(如下图所示)。这种方法检测的特点: 1. 信号窗口大,灵敏度高。 2. 步骤简单,实验时长较短。





虽然基于MSD平台的桥连法非常经典,也因此成为最常用的ADA方法,但是此方法同样具有其弱势:1.有些药物因为其特殊的空间结构(如PEG修饰的药物),致使ADA只能有一端抗体臂同药物结合,另一端无法再同药物结合,此时桥连法便失效。2. 桥连法需对药物进行生物素和钌标记,有些药物在进行多重修饰后(如多肽修饰,PEG修饰),失去了活性氨基端,无法进行有效标记,或者更高难度的巯基或羧基端标记产生的信号有限,导致此方法较大的局限性。





下面针对这两点问题提出有效的assay format优化建议。


二. 空间位阻导致的桥连法失效,可切换到如下模式对ADA进行检测。这种模式需要对样品进行酸化提取前处理,然后将酸化提取出的ADA直接包被在板上,使用生物素标记的药物作为检测抗体,即使一个ADA分子只能结合一个药物分子也能满足方法设计要求。这种方式有效地规避了ADA不能同时与两个药物分子结合的局限性。





三. 如果药物不能进行有效标记,会大大增大ADA方法设计的难度。此时可选择如下模式对ADA进行检测(如下图,以阳性抗体为兔多抗,临床样品检测举例)。这种方法避免了对药物的标记,如果有需要同时检出IgG, IgM, IgA,等,也可考虑选用同时抗IgG, IgM, IgA的混合检测抗体。在进行方法开发时(没有真实样品的情形下),以临床为例,需要设置human IgG的阳性对照,以验证检测抗体中的anti-human IgG部分正常工作(Rabbit PCs是被anti-rabbit IgG部分检出的,不能充分证实检测抗体能完整地正常工作)。此方法虽然是退而求其次的选择,但因为其特殊的检测抗体的使用,其也具备其它方法没有的先天优势:1. 不受靶点干扰。2. 具备很好的药物耐受水平。3. 通常情况下具备很好的灵敏度。


ADA的assay format优化在方法开发中是一种很有趣的探索,除了上述的方法外,还可以在很多细节处进行摸索优化,或者其它平台进行相似的转换,也可以探索更多的除了生物素标记,钌标记,HRP标记等以外的更多类型的标记方法来进行更广泛的尝试。


参考文献:



  • Recommendations for the design and optimization of immunoassays used in the detection of host antibodies against biotechnology products. Journal of Immunological Methods. Anthony R. Mire-Sluis
  • Recommendations for the validation of immunoassays used for detection of host antibodies against biotechnology products. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. Gopi Shankar.
  • Drug target interference in immunogenicity assays: recommendations and mitigation strategies. The AAPS Journal. Zhandong Don Zhong