使用LBA分析方法进行大分子生物标志物的定量检测分析——从平行度开始
来源:宁波熙宁检测技术有限公司    |    发布时间:2020-12-15 14:48:00    |    点击:

在配体结合分析方法(Ligand Binding Assay,LBA)中,通过对比已知浓度的标准曲线点和未知浓度的待测样品的免疫反应性,可以实现生物大分子的定量检测。对于一个开发好的LBA,标准曲线和分析物的稀释曲线应该是平行的以证明标准曲线和分析物的抗体结合特性是足够相似的。对于PK分析方法,在绝大多数情况下,使用的标准对照品和分析物是相同的,且大多数情况下分析物也没有内源性,很少会出现稀释曲线不平行的问题。然而,在生物标志物的检测上,情况就大不相同了。


在使用LBA进行大分子生物标志物的检测时,有两个最基本的问题往往很难避免,其中一个问题是使用的标准对照品和内源性分析物之间的差异性。在大分子生物标志物的检测上,所使用的标准品通常是重组蛋白,和天然的内源性分析物之间在理化性质以及结构上都是有一定的差异的,再加上天然大分子生物标志物结构的复杂性和存在形式的多样性,所以从本质上来说,大分子生物标志物的LBA检测方法并不是绝对定量,而是相对定量。另一个不可忽视的问题是分析物的内源性。大部分的生物标志物都有不可忽略的内源性浓度,所以在开发分析方法时,通常都会遇到替代基质的选择问题,这也给方法开发带来了额外的挑战。


正是由于这两个最基本的问题,才使得平行度成为大分子生物标志物分析方法开发的基础。通过对平行度的评估和测试,我们可以对LBA检测的相对准确度有一个很好的了解,同时,方法选择的标准对照品及其替代基质是否合适、方法的选择性和基质效应、最小稀释倍数(MRD)和稀释线性、方法的定量下限(LLOQ)等参数也可以在平行度实验中得到一定的体现。


平行度和标准对照品及替代基质的选择

一般来说,有两个主要的因素会导致标准曲线和内源性分析物的稀释曲线不平行:标准对照品和内源性分析物对于结合试剂(例如捕获和检测抗体)之间免疫亲和特性上的差异,以及标准曲线的替代基质环境和待测样品的生物基质环境的不同的基质效应(如下图1)。











图1    导致不平行的2个主要因素



(A) 标准曲线:在替代基质中配制的标准对照品

(B) 真实样品:在生物基质中的内源性分析物

在平行度测试中,如果多个个体基质样品结果显示其稀释曲线相互之间平行度良好,但是却和标准曲线不平行,那么很有可能意味着所使用的标准品有问题,需要评估其他来源的标准品。对于替代基质的选择,总的来说,良好的平行度结果可以表明所选择的替代基质是合适的,所以平行度实验也可作为早期方法开发阶段中用于选择合适的替代基质的测试。



平行度和选择性及基质效应

和小分子检测方法不同,使用LBA方法检测生物基质中的大分子分析物时,一般是不需要对样品做提取或者萃取的,所以在方法的反应阶段,分析物是处在一个复杂的基质环境中的。比较理想化的情况是,使用的捕获和检测试剂只和待测分析物特异性的结合且和其他基质中存在的化合物没有交叉反应,但在大部分实际的情况下,在真实的生物样品检测中,基质中的内源性成分往往会对这些结合有干扰。内源性成分可以特异性或者非特异性的和捕获试剂、检测试剂或者分析物之间结合,从而导致最终检测信号的升高或者降低,因此,对基质效应进行评估是LBA分析方法中重要的一环。

对于生物标志物方法而言,在绝大多数情形下,天然的空白基质都是不可得的,所以对基质效应的评估不是采取和PK方法相同的加入回收的策略来进行,而是使用平行度实验对测试样品在不同稀释倍数下的相对准确度来进行评估。同时,通过观察平行度实验中不同个体基质稀释曲线间的平行度情况,也可以对方法在不同个体基质中的选择性有所了解。



平行度和MRD及稀释线性

平行度测试也可用于评估方法的MRD,如图2所示,从理论上而言,在选择了合适的标准对照品的前提下,使用配制标准曲线的替代基质对样品进行稀释时,随着稀释倍数越来越大,样品和标准品所处的环境就越接近,样品的稀释曲线和标准对照品的稀释曲线便越来越趋近于平行,所以从理论上来说,只要选择一个合适的稀释倍数作为样品的MRD,就可以保证方法的平行度(当然在有些方法中,样品不稀释时便可以达到很好的平行度)。

我们会根据多个个体样品的平行度稀释曲线结果来确定在哪个稀释水平上样品往下稀释可以达到满意的相对准确度,在具体的评估方式上,我们使用在MRD水平的样品值作为参照值,通过其下面的稀释倍数的回算结果的准确度来判断所设定的MRD是否合适。另外,从平行度实验中样品的稀释曲线也可以看出分析方法部分的稀释线性结果。

在使用平行度进行MRD的评估上,有一点也值得一提的是,如果评估出的MRD过于高,可能会导致灵敏度的不足。有时,平行度在某一个区段是可以满足接受标准的,如果预测样品浓度很低,也可以基于实际的使用目的采取一些相应的策略。



图2    样品稀释度和平行度示例



平行度和LLOQ

上文提过,生物标志物方法中所用的标准品通常和内源性的分析物有所不同,并且可能会和方法的关键试剂有不同程度的相互作用差异,所以生物标志物方法的灵敏度(也就是定量下限LLOQ)应该是通过能准确定量的内源性分析物的浓度水平来反映才更合适的,这个也可以在平行度实验中有所体现。在平行度实验中,可以将多个个体样品进行序列稀释到方法的检测限以下,其中各个样品中所得的最小的符合平行度的浓度值便可以作为LLOQ的参考值。


平行度测试的局限性

平行度测试的前提是样品能达到足够的内源性水平以进行序列的稀释,但是在实际的分析中,经常也会遇到很多内源性浓度不够进行平行度测试的情况。对于这种情况,业内也有过很多讨论并且也有提出一些解决方案,其中一种方案是生产内源性的分析物(如使用刺激细胞的方式生产细胞因子),然后将它加入到个体基质中进行平行度的评估。另外一种很常见的方案是使用标准对照品(往往是重组蛋白)加入到个体基质中进行实验。

虽然采用这些方式也可以提供一些相对的证据证明使用的关键试剂对于检测内源性物质和标准品是相似的,但从本质上来说,这些都是不完美的折中方式,我们对这种方式的有效性还是需要很谨慎的对待。这些方式也仅仅在合适的内源性样品无法获得时可以考虑采用,一旦合适的内源性样品可得了(通常是在样品分析中),便需要尽快使用内源性样品进行平行度实验,如果实验结果和之前的方法有所矛盾,则需要对之前的分析方法做修正或者基于平行度结果制定下一步的分析策略。




参考文献:

• Sai P Thankamony, Yan Zhang, Exploratory biomarker assays: key assay parameters to evaluate in the face of evolving biomarker context-of-use, Bioanalysis, Volume 11, Issue 23, 28 Nov 2019

• Susan Richards, Lakshmi Amaravadi, Renuka Pillutla, et al., 2016 White Paper on recent issues in bioanalysis: focus on biomarker assay validation (BAV): (Part 3 –LBA, biomarkers and immunogenicity), Bioanalysis, Volume 8, Issue 23, 01 Nov 2016

• Akira Wakamatsu, Shoko Ochiai, Eiko Suzuki, et al., Proposed selection strategy of surrogate matrix to quantify endogenous substances by Japan Bioanalysis Forum DG2015-15, Bioanalysis, Volume 10, Issue 17, 01 Sep 2018