白血病微小残留病检测(MRD)
来源:宁波熙宁检测技术有限公司    |    发布时间:2020-11-19 09:33:00    |    点击:

        近几年细胞治疗持续升温,今年五月份,国家药品监督管理局发布《抗急性淋巴细胞白血病药物临床试验中检测微小残留病的技术指导原则(征求意见稿)》。微小残留病(MRD)是指白血病诱导化疗完全缓解后(或骨髓移植治疗后),在体内残留少量白血病细胞的状态,这些残存的细胞即成为白血病复发的根源。微小残留病检测可以反映治疗后的反应程度和白血病细胞负荷,也可以成为复发风险的预测因子,是决定患者的危险分层、预后判断、后续治疗选择的关键因素之一,也因此成为临床治疗中进行疾病监测的重要指标。在国内,流式(目前多为4~8色)微小残留病检测(MRD)是应用最广泛的ALL MRD检测手段,但在临床研究尤其关键性注册临床研究中的合理应用MRD依然面临诸多挑战。在实际应用中,有不少影响标准化检测的因素,例如仪器的稳定性、临床样本的稳定性、专业人员的培养等等。所以只能说,MRD的标准化依然任重而道远,在这之前只能依靠各实验室内部的人员和质量控制来保证方法的准确性和合规性。

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MRD检测原理

        流式细胞术(FCM)检测MRD的原理是通过分析细胞表面或胞内一系列抗原的表达模式(如图一)来识别只在白血病细胞中出现而正常骨髓中不存在或存在比例极低的免疫表型,即“白血病相关免疫表型”(1eukemia-associated immunophenotypes,LAIP)。根据抗原表达特点将LAIP分为以下几种表现形式:跨系抗原表达、非同步抗原表达、抗原表达量异常、散射光信号异常以及表达少数白血病特异性抗原。跨系抗原是指某一系列的细胞表达其他系列的抗原,如B-ALL的白血病细胞中表达髓系抗原CD66C、CDl3、CD33等;非同步抗原表达是指应该分别出现在分化早期和晚期的抗原同时出现,如AML中CDllb(晚期)和CD34(早期)共表达;抗原表达量异常指与同系列、相同分化阶段的正常造血细胞比较,白血病细胞中某些抗原的表达强度明显异常,包括减低(low expression,low)、缺失或升高(bright expression,bri),如正常CDl9+CD34+B系原始淋巴细胞应该高表达CD38,B-ALL中白血病细胞则低表达甚至不表达CD38。另外,白血病细胞经常出现前向散射光(forward scatter,FSC)和侧向散射光(side scatter,SSC)的改变,也可以作为识别白血病细胞的依据。




图一  正常骨髓B细胞表面抗原表达模式




MRD检测方法

        在MRD数据分析的实际应用中,主要存在2种方法:第一种,根据患者发病时的LAIP设计特异性的抗体组合,选择固定的门(gate)对特定的细胞群进行设门分析,例如对发病时具有CDl0+CD38- 一LAIP特征的B-ALL患者,通常以CDl9+细胞设门,重点分析是否存CDl0+CD38-细胞;第二种,始终以同系列相同分化阶段的正常细胞作为对照,在每次检测时观察是否存在与正常细胞表型不同的细胞群体,即“不同于正常细胞表型”(different-from-normal,DFN)的方法。第一种方法的优点是对于初学者比较容易掌握,但缺点是依赖初治时的免疫表型,如果初治时没有检测免疫分型,则无法进行MRD检测;另外,在疾病的进展过程中,由于不同治疗方案对白血病细胞分化、克隆筛选以及表型漂移等因素的影响,仅依据初治LAIP及固定门分析MRD时,有可能导致假阴性结果。第二种方法避免了第一种方法的缺点,在MRD监测过程中可以及时发现病情变化后新出现的LAIP表型,提高检测的敏感性;但需要检测者熟练掌握正常细胞不同系列、不同分化阶段、不同种抗原表达的规律,包括抗原出现的时序性及抗原表达量的强弱变化规律。因此,对检查者的经验要求较高。而对于AML患者,因抗原变化较复杂,为避免漏诊,需要每次筛查较多的抗原,从而会增加每次检测的费用。对于T-ALL及B—ALL,目前研究表明,单管8~10种抗原同时检测,几乎可以覆盖所有的患者。我们主张两种方法要有机地结合起来,即如果能够依据第一种方法的原则进行检测时,也要兼顾第二种方法的原则,既要关注发病时的LAIP,同时也要关注是否出现新的“DFN”的LAIP,以发挥第一种检测方法的优点及克服其缺点,达到既经济又准确的结果。但如果不具备初治时免疫表型,只能采用第二种方法进行检测。




检测样本的选择(骨髓、外周血)

        由于不同类型恶性血液病的细胞起源、遗传学背景、生物学特征、药物敏感性等因素的影响,化疗后不同时期,骨髓和外周血中肿瘤细胞的清除速率存在不同程度的差异。在AML的研究中发现,在化疗后早期(3—7 d),由于尚未达到形态学缓解,外周血中还存在一定负荷的肿瘤细胞,因此在早期采取创伤性较小的外周血检测,背景细胞的干扰很少,MRD检测的敏感性和特异性较高。通过计算肿瘤负荷下降的速度可以判断其对治疗方案的敏感性,对于疾病的预后分层有一定的指导意义。而在达到形态学缓解后,骨髓的检测要明显优于外周血检测,二者的检测敏感性至少相差一个对数级。国外的大样本研究证实,T-ALL的MRD检测由于具有比较特异的LAIP,因此较易在骨髓和外周血中检出,T-ALL的MRD检测在外周血的检测敏感性大致接近或略低于骨髓(约减低1个对数级)。在B-ALL的MRD检测对比研究中发现,外周血的MRD检测敏感性比同期骨髓减低了1—3个对数级,因此对于B—ALL的MRD检测建议首选骨髓。另外,由于儿童B—ALL治疗方案已实现标准化,并且方案中已纳入了MRD的指导策略,国外对于骨髓样本的抽取强烈推荐选取第一管骨髓,以避免在抽取过程中造成不同程度的外周血稀释,而且建议抽取量不宜过多(一般在2 mL左右,<5mL)。当然,样本的留取量要保证检测的敏感性,如要达到10-4的检测敏感性,并以检出≥50个异常细胞为判断标准,则抽取细胞数需≥1×1067。




MRD适用范围

        FCM-MRD在急性白血病(B-ALL/T-ALLALL/AML)和多发性骨髓瘤(MM)中已经广泛应用,FCM-MRD技术在非霍奇金淋巴瘤(NHL)中主要用于以白血病形式存在或者出现骨髓浸润的B细胞淋巴瘤,T/NK细胞淋巴瘤与正常淋巴细胞在抗原表达模式上存在较大程度的重叠,且常缺乏明确的克隆性依据,导致检测灵敏度过低,限制了该技术在这组疾病MRD监测中的应用。理论上只要初发时在骨髓或外周血中能检出肿瘤细胞,并且具有相关异常免疫表型,治疗后均可进行MRD检测。